Fmoc保護試薬：Fmoc-Amox

ほとんどのペプチド合成は、Fmoc または Boc 保護法を使用した固相ペプチド合成によって達成されますが、Fmoc-OSu を使用すると、アミノ酸内にジペプチド (またはトリペプチド) および β-アラニンアミド不純物が形成されるため、保護されていないペプチドが導入されます。 Fmoc の N は難しいようです。ここでは、オキシム誘導体 Fmoc-Amox をベースに副反応を起こさずに Fmoc-Gly-OH を効率的に合成する方法を紹介します。 Fmoc-Amox は安価であり、反応後に Amox を簡単に除去できるため、有害な不純物や汚染物質 (主にジペプチドまたは Amox 自体) を含まない純粋な Fmoc-Gly-OH が得られます。これは、高効率液相クロマトグラフィーおよびNMRが実証されました。

1963 年、メリフィールドは化学合成の新しい概念を説明しました。市販されている一部の医薬品の有効成分 (API) は TIDES (オリゴヌクレオチドおよびペプチド治療薬) であり、これには 30 ～ 40 ものモノマーが含まれています。これらの物体は、Merrifield によって最初に記載された固相法を使用して生成されました。固相ペプチド合成 (SPPS) 法は当初、ヨーロッパの同僚によってある程度疑問視されていましたが、現在では合成研究と生産に広く使用されています。

命名法からわかるように、すべてのアミノ酸は少なくとも 2 つの官能基、つまりカルボン酸とアミノ基を持っています。アミノ酸のC末端カルボン酸の活性が不溶性高分子基で覆われている場合、アミノ基は一時的に保護され、アミノ基の保護基を除去するなど段階的かつ継続的に反応に参加します。次に、次のN-保護アミノ酸カプレットとカップリングします。ただし、三官能性アミノ酸の場合、側鎖は永久 (または半永久) 保護基によって保護されます。初期の頃、メリフィールドは長期保護にベンジル (Bn) を、一時的な保護基として start-ブトキシカルボニル (Boc) を使用しましたが、Boc と Bn は両方とも酸性条件下で分解する可能性があります: トリフルオロ酢酸 (TFA) de-Boc , HF やトリフルオロメタンスルホン酸 (TFMSA) などの強酸は Bn を加水分解します。 1970 年代に、Boc 保護基も提案したカルピノは、アミノ基を一時的に保護するための基としてフルオレニルメチルオキシカルボニル (Fmoc) を提案し、ペプチド化学の分野に革命をもたらしました。つまり、N 保護基は塩基で除去できます。したがって、これは Boc 群に対して直交します。さらに、ヨーロッパのSheppardとAthertonは、米国のChangとMeienhoferとともに、Fmoc/t-Bu法を同時に開発し、反応をTFA溶液で処理してペプチドを遊離させました。この方法の導入は、社会の「文明化」を特徴づけます。 Boc/Bn 法の使用には訓練を受けた化学者と特殊な装置が必要ですが、Fmoc/t-Bu 法の使用により、他の生物学的研究室でもペプチドを合成できるためです。さらに、この方法によりキログラムスケールのペプチドの生産が可能になりました。

最初の商用 Fmoc アミノ酸はショッテン バウマン法によって合成されました。アミノ酸は塩基性条件下で Fmoc-Cl と反応しました (図 1A)。 1980 年代初頭、Ashish グループと Bachem および Goodman は、ほとんどの市販の Fmoc アミノ酸にはジペプチドとトリペプチドが含まれていることを指摘しました。これらの不純物は、保護されるアミノ酸のカルボキシル基とも反応する可能性がある Fmoc-Cl の高い反応性に由来します。無水物は、別のアミノ酸分子のアミン末端と反応して、ジペプチドを形成します。そのメカニズムを図 1B に示します。

図 1 アミノ酸の Fmoc 保護
A. FMOC 保護メカニズム
B. アミノ酸保護中の保護されたジペプチド形成のメカニズム

たとえ少量の不純物であっても収率と純度の損失につながる可能性があることを考慮すると、両当事者は共同して、Fmoc-Cl は避けるべきであると結論付けました。これらの副反応は脱離基の質量に関連しているため、Ashish のグループは Fmoc-N3 を使用することを提案し、Carpino と Han も論文で言及しています。 Ashish グループは、Fmoc-Cl とアジ化ナトリウムを用いて Fmoc-N3 を合成することを提案しました。 Fmoc-N3の調製と保管の危険性を避けるために、現在はFmoc-N3が使用されています。この方法で合成された Fmoc アミノ酸はより高純度です。バーランダーら。 Bolinらは、異なる脱離基をスクリーニングすることによるFmoc-OSUの使用を提案した。カルボキシル基を保護するためにシリル化試薬の使用を提案しました。何年も後、Barlos らは、Trt エステル不純物の形成を避けるために、Trt-Cl から Trt-アミノ酸を調製する方法を提案しました。その後、Suresh ら。は、中性条件を可能にする活性化亜鉛粉末の存在下で、Fmoc-Cl から Fmoc-アミノ酸を調製することを提案しました。

しかし、長い間、Fmoc アミノ酸の合成に最も一般的に使用されていた方法は Fmoc-OSu (または NHS) であり、Hlebowicz らの研究でも疑問視されました。 Bachem Europe の研究では、Fmoc-OSu を使用して調製された Fmoc-AA-OH には Fmoc-β-Ala-OH と Fmoc-β-Ala-AA-OH が含まれており、OSu がカルボニルを攻撃した後にこれら 2 つの不純物がロッセンを通過することが示されています。グループ。再配置によって形成されます (図 2)。

図2 ロッセン転位によるβ-アラニンアミドの生成機構

これらの発見は、Fmoc 基を安全に導入するための新しい試薬や方法の開発に対する研究の熱意を再活性化しました。表 1 に、アミノ酸の保護に使用されるさまざまな Fmoc 誘導体と、Fmoc-Gly-OH の調製におけるそれらの結果を示します。この反応はすべてのアミノ酸の保護に使用できますが、Gly は立体障害が低いため、より明白です。高効率な重合に貢献します。これらの Fmoc 導入誘導体には 2 つの重要な特徴があります。(i) 特別に高い反応性がなく、オリゴペプチドの形成を回避します。 (ii) 脱離基は通常、アミノ酸で置換されたヒドロキシル化合物であり、処理中に比較的安定です。取り外しが簡単になります。したがって、Ashish グループは、オリゴペプチドの少ない Fmoc 誘導体を合成する Fmoc-2-メルカプトベンズイミダゾールを最初に提案しました (表 1、#4)。ただし、反応で放出される副生成物 2-MBT は溶解度が低いため、有機溶媒で洗浄して完全に除去する必要があります。一方、Fmoc アミノ酸も有機溶媒に対してある程度の溶解度があるため、最終収率にはつながりません。 Verlander らも同様の問題に直面しました。(ポリ)クロロフェニル誘導体を使用する場合、有機溶媒アルコールが最終生成物を汚染し、全体の収率が低くなります (4 ～ 30%)。

フタルイミド、ノルボルネニル (ノルボルネンから誘導されるフリーラジカル) などの他のスクシンイミドの誘導体、および対応するスピロ類似体、6 員環誘導体なども分析されましたが、大きな利点はありませんでした (表 1) 、#5-7)。同時に、水中での固相ペプチド合成 (SPPS) のためにノルボルネン基を EDC と結合させると、β-アラニンの形成が検出されました。スクシンイミド誘導体の使用によって引き起こされるβ-アラニンアミド残基のインターカレーションの問題を克服するために、Najera et al.はポリマーの形態の試薬を提案し、最終的なβ-アラニンアミド汚染物質はポリマー支持体上に固定化されました。しかしながら、この方法は少量の保護されたアミノ酸を調製する場合の使用に限定されます。

ペンタフルオロフェニル (Pfp) やベンゾトリアゾール (Bt) などのカルボジイミド カップリング化合物とよく使用される他の反応性物質。これらの試薬は比較的高価 (Pfp) または爆発性 (Bt) (表 1、#8、9) ですが、収率は高くなります。 、そしていくつかの研究室は、Fmoc-アミノ酸を合成する方法として Fmoc-トリアジン誘導体 (表 1、#10) を研究しています。純粋な水溶液を使用して Fmoc を導入する方法には、Fmoc-フェニル ジメチル スルホニウム メチル サルフェート (Fmoc-ODsp) が使用されていますが、ジペプチドの形成については検討されていませんでした (表 1、#11)。

ペプチド構成要素の合成における最大の課題の 1 つ、すなわちアミノ酸保護中の望ましくないジペプチドおよびトリペプチドの形成を克服するために、多数の Fmoc 脱離基を使用するアプローチが集中的に研究されてきました。少数の試薬はまともな結果をもたらしましたが、工業生産に使用できる可能性のある試薬はほとんどありません。これに関して、一般的に使用されるカルボジイミド添加剤オキシムの構造に基づいて、Fmoc 脱離基誘導体 Fmoc-Amox が提案されました。 Fmoc-Amox は、副反応が非常に起こりやすい H-Gly-OH を高収率 (93%) で保護するために使用されており、Fmoc-ジペプチドの形で副生成物がまったく発生しません。 HPLC および NMR 分析で確認できます。さらに、Amox 誘導体は、将来的には、pNZ、Alloc、Boc などの他の保護基を導入するために使用される可能性があります。

アシッシュグループは、オキシマがカルボジイミドよりも優れた添加剤であると信じています。オキシマは強い反応性を持っており、ペプチドの工業生産にますます広く使用されています。同グループは、最初のスクリーニング（表 1、#12～16）から、Oxyma 由来の 2-ヒドロキシピリジン N-オキシド (HOPO) を含む、Fmoc 基を導入するための他の反応性の低いオキシム誘導体も調査しました (表 1、#12)。反応性が高いため、ジペプチドの含有量が高く、HOPO がそれに続きます (表 1、#16)。シアノピリジニウム オキシムも優れた添加剤ですが (表 1、#15)、高価であり、反応から除去するのが困難です。 2 番目のスクリーニングでのジペプチド形成は一般に少ないため (表 1、#17-20)、Fmoc を導入するための HOSu の代替としてシアノアミド誘導体 (Amox) (表 1、#20) が選択されました。 Fmoc-Amox は手頃な価格であり、MBT の場合とは異なり、反応後に簡単に除去できます。Amox は水に対する溶解度が 0.9 M であるため、最終的な Fmoc アミノ酸を汚染しません (表 1、#4)。 。

Fmoc-ジペプチド形成に関しては、H-Gly-OH は立体障害が低くオリゴマー化率が高いため、Fmoc-Amox の性能を評価するのに最適な試薬であることが証明されました。 1 グラムと 40 グラムの 2 つの並行実験を使用して Fmoc-Gly-OH を調製すると、結果は近くなり、反応プロセスは次のように説明されます。Fmoc-Amox のアセトン溶液を、撹拌した H-Gly-OH とナトリウムにゆっくりと加えます。炭酸ナトリウム水溶液を連続的に分離し、炭酸ナトリウムをバッチ式で添加して、反応混合物のpHを9〜10に維持した。反応をＴＬＣおよびｐＨ安定性（反応の兆候としてのｐＨの低下）によって監視した。反応が完了した後(4時間)、溶媒を除去し、残った水層をDCMで洗浄し、続いて1N HClを(pH<2まで)添加すると、オフホワイトの沈殿物が得られ、これを濾過した。再結晶後、HPLCで検出したFmoc-Gly-OHの純度は非常に良好でした。固相法で調製したFmoc-Gly-Gly-OHはFmoc-Gly-OHとともに溶出するため、図3に示すようにクロマトグラムでは観察されず、生成したジペプチド不純物の除去が困難であることを示しています。ジペプチドの痕跡 (図 3)。さらに、 1 H NMR では Amox の汚染はまったく示されませんでした (図 4)。これは、Amox が Fmoc アミノ酸の合成において大きな利点を持っていることを明確に示しています。

図 3 (A) 一緒に溶出する Fmoc-Gly-OH と Fmoc-Gly-Gly-OH の HPLC クロマトグラム
(B) Fmoc-Gly-OH の HPLC クロマトグラム

図 4 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Amox、Amox の 1H および 13C NMR の比較

これらの結果に基づいて、Fmoc-Phe-OH および Fmoc-Val-OH (それぞれ 10 g のミニトライアル) を、上記の方法を使用して調製しました (図 5 および 6)。最終生成物の純度は HPLC および NMR によって確認され、ジペプチドの生成は痕跡なしでした。後処理中の溶媒の重要性も調査されました。得られた生成物をDCMに溶解し、蒸留水を使用して抽出した。 DCM 処理により痕跡量の Amox が除去され、NMR で確認されたように純粋な生成物が得られました (図 7)。

図 5 (I) A. 一緒に溶出する Fmoc-Phe-OH と Fmoc-Phe-Phe-OH の HPLC クロマトグラム
B. Fmoc-Phe-OH
の HPLC クロマトグラム (II) Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Amox および Amox の 1H および 13C NMR 比較

図 6 (I) A. 一緒に溶出する Fmoc-Val-OH と Fmoc-Val-Val-OH の HPLC クロマトグラム
B. Fmoc-Val-OH
の HPLC クロマトグラム (II) Fmoc-Val-OH、Fmoc-Amox および Amox の 1H および 13C NMR 比較

図 7 酢酸エチルと DCM で抽出した Fmoc-Phe-OH の後処理の比較

これらの結果は、Fmoc-Amox が副反応が最も起こりやすい Fmoc アミノ酸の合成において大きな利点があることを明確に示しています。

Fmocアミノ酸の合成例:

1. 精製水にグリシン (131.34 mmol) と炭酸ナトリウム (106 mmol) を加え、反応溶液の pH が常に 9 ～ 10 に保たれるように Fmoc-Amox (119.4 mmol) のアセトン溶液を滴下します。 Fmoc-Amox反応が完了したことをTLCが検出した後、反応溶液を濃縮してアセトンを除去し、次いでジクロロメタンで抽出して不純物を除去した。水相を１Ｎ ＨＣｌで酸性化し、大量の白色固体が沈殿した。濾過後、濾過ケーキを精製水で３回洗浄した。回収した固体を酢酸エチル/n-ヘキサンで再結晶し、高純度のFmoc-グリシンを得た。

2. フェニルアラニンまたはバリン (33 mmol) と炭酸ナトリウム (75 mmol) を精製水に加え、反応溶液の pH が常に 9 ～ 10 に保たれるように Fmoc-Amox (30 mmol) アセトン溶液を滴下します。 Fmoc-Amox反応が完了したことをTLCが検出した後、反応溶液を濃縮してアセトンを除去し、次いでジクロロメタンで抽出して不純物を除去した。水相を１Ｎ ＨＣｌで酸性化し、大量の白色固体が沈殿した。濾過後、濾過ケーキを精製水で３回洗浄した。回収した固体を酢酸エチル/n-ヘキサンで再結晶することにより、高純度のFmoc-フェニルアラニンまたはFmoc-バリンを得た。

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