Fmoc保護試薬：Fmoc-Amox

ほとんどのペプチド合成は、Fmoc または Boc 保護法を使用した固相ペプチド合成によって達成されますが、Fmoc-OSu を使用すると、ジペプチド (またはトリペプチド) および β-アラニンアミド不純物の形成により、アミノ酸の Fmoc への保護されていない N の導入が困難になるようです。ここでは、オキシム誘導体 Fmoc-Amox に基づいて、副反応なしで Fmoc-Gly-OH を合成する効率的な方法を紹介します。Fmoc-Amox は安価であり、Amox は反応後に簡単に除去できるため、有害な不純物や汚染物質 (主にジペプチドまたは Amox 自体) のない純粋な Fmoc-Gly-OH が得られ、高効率液相クロマトグラフィーと NMR から得られることが実証されました。

1963 年、メリフィールドは化学合成の新しい概念を提唱しました。市場に出回っている一部の医薬品の有効成分 (API) は TIDES (オリゴヌクレオチドおよびペプチド治療薬) で、30 ～ 40 個ものモノマーが含まれています。この物質はメリフィールドが初めて提唱した固相法で製造されました。固相ペプチド合成 (SPPS) 法は当初、ヨーロッパの同僚からある程度疑問視されていましたが、現在では合成研究および製造で広く使用されています。

命名法からわかるように、すべてのアミノ酸には、少なくとも 2 つの官能基、つまりカルボン酸とアミノ基があります。アミノ酸の C 末端カルボン酸の活性が不溶性ポリマー基で覆われている場合、アミノ基は一時的に保護され、その後、アミノ基の保護基を除去し、次の N 保護アミノ酸対とカップリングすることを含め、段階的に連続的に反応に参加します。ただし、三官能性アミノ酸の場合、側鎖は永久 (または半永久) 保護基によって保護されています。初期の頃、メリフィールドは長期保護にベンジル (Bn)、一時保護基として tert-ブトキシカルボニル (Boc) を使用していましたが、Boc と Bn はどちらも酸性条件下で分解される可能性があります。トリフルオロ酢酸 (TFA) は Boc を脱離し、HF などの強酸やトリフルオロメタンスルホン酸 (TFMSA) は Bn を加水分解します。 1970年代、Boc保護基も提唱したカルピノは、アミノ基を一時的に保護する基としてフルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）を提案し、ペプチド化学の分野に革命をもたらしました。つまり、N保護基は塩基で除去でき、したがってBoc基と直交します。さらに、ヨーロッパのシェパードとアサートンは、米国のチャンとマイエンホファーと共同で、Fmoc / t-Bu法を同時に開発し、反応をTFA溶液で処理してペプチドを放出しました。この方法の実装は、ペプチド合成の「民間化」を示しています。Boc / Bn法の使用には、訓練された化学者と特別な装置が必要ですが、Fmoc / t-Bu法を通じて、他の生物学研究室でもペプチドを合成できるためです。さらに、この方法により、キログラム規模のペプチドの製造が可能になりました。

最初の市販の Fmoc アミノ酸は、ショッテン・バウマン法で合成されました。アミノ酸は、塩基性条件下で Fmoc-Cl と反応しました (図 1A)。1980 年代初頭、Ashish グループと Bachem および Goodman は、市販の Fmoc アミノ酸のほとんどにジペプチドとトリペプチドが含まれていることを指摘しました。これらの不純物は、保護するアミノ酸のカルボキシル基と反応する可能性のある Fmoc-Cl の高い反応性から生じます。無水物は、別のアミノ酸分子のアミン末端と反応して、ジペプチドを形成します。そのメカニズムを図 1B に示します。

図1 アミノ酸のFmoc保護
A. Fmoc保護メカニズム
B. アミノ酸保護中の保護ジペプチド形成メカニズム

不純物が少しでも混入すると収率や純度が低下する可能性があることを考慮し、両者は共同で Fmoc-Cl は使用しない方が良いという結論に達しました。これらの副反応は脱離基の質量に関係するため、Ashish らは Carpino と Han も論文で言及している Fmoc-N3 の使用を提案しました。Ashish らは、Fmoc-Cl とアジ化ナトリウムを使用して Fmoc-N3 を合成することを提案しました。Fmoc-N3 の調製と保管の危険性を回避するために、現在はそれが使用されています。この方法で合成された Fmoc アミノ酸は純度が高くなります。Verlander らは、異なる脱離基をスクリーニングして Fmoc-OSU を使用することを提案し、Bolin らはカルボキシル基を保護するためにシリル化試薬を使用することを提案しました。何年も経ってから、Barlos らは、Trt エステル不純物の形成を避けるために、Trt-Cl から Trt アミノ酸を調製する方法を提案しました。中性条件を可能にする活性化亜鉛粉末の存在下でFmoc-ClからFmoc-アミノ酸を調製することを提案した。

しかし、長い間、Fmoc-アミノ酸の合成に最も一般的に使用されていた方法は Fmoc-OSu (または NHS) であり、Hlebowicz らが Bachem Europe の調査で、Fmoc-OSu を使用して調製された Fmoc-AA-OH には Fmoc-β-Ala-OH と Fmoc-β-Ala-AA-OH が含まれており、これら 2 つの不純物は OSu がカルボニル基を攻撃した後に Lossen を通過して転位によって形成されることが示されたときにも疑問視されました (図 2)。

図2 ロッセン転位によるβ-アラニンアミドの形成メカニズム

これらの発見は、Fmoc基を安全に導入するための新しい試薬や方法の開発に対する研究熱を再び高めました。表1は、アミノ酸を保護するために使用されるさまざまなFmoc誘導体と、Fmoc-Gly-OHの調製に対するそれらの結果を示しています。この反応はすべてのアミノ酸の保護に使用できますが、Glyは立体障害が低いため、より明白です。高効率の重合につながります。これらのFmoc導入誘導体は、2つの重要な特徴を持つ必要があります：（i）特別な高反応性がなく、オリゴペプチドの形成を回避します。（ii）脱離基は通常、アミノ酸で置換されたヒドロキシル化合物であり、処理中に比較的安定しています。除去が容易です。そのため、Ashishグループは最初にFmoc-2-メルカプトベンズイミダゾールを提案し、より少ないオリゴペプチドでFmoc誘導体を合成しました（表1、＃4）。しかし、反応中に放出される副産物 2-MBT は溶解性が低いため、有機溶媒で洗浄することによって完全に除去する必要があります。一方、Fmoc アミノ酸も有機溶媒にある程度溶解するため、最終収率にはつながりません。Verlander らも同様の問題に直面しており、(ポリ)クロロフェニル誘導体を使用すると、有機溶媒アルコールが最終製品を汚染し、全体的な収率が低くなります (4-30%)。

フタルイミド、ノルボルネニル（ノルボルネンから誘導されるフリーラジカル）および対応するスピロ類似体、6員環誘導体などの他のスクシンイミドの誘導体も分析されましたが、大きな利点はありませんでした（表1、＃5-7）。同時に、ノルボルネン基をEDCと組み合わせて水中で固相ペプチド合成（SPPS）すると、β-アラニンの形成が検出されました。スクシンイミド誘導体の使用によって引き起こされるβ-アラニンアミド残基の挿入の問題を克服するために、Najeraらはポリマーの形の試薬を提案し、最終的なβ-アラニンアミド汚染物質はポリマー支持体上に固定されましたが、この方法では少量の保護アミノ酸を調製するための使用が制限されます。

カルボジイミドカップリング化合物と一般的に使用される他の反応性物質には、ペンタフルオロフェニル（Pfp）やベンゾトリアゾール（Bt）などがありますが、これらの試薬は比較的高価（Pfp）または爆発性（Bt）（表1、＃8、9）ですが、収率が高く、一部の研究室ではFmoc-アミノ酸を合成する方法としてFmoc-トリアジン誘導体（表1、＃10）を調査しています。純粋な水溶液を使用してFmocを導入する方法としては、Fmoc-フェニルジメチルスルホニウムメチル硫酸塩（Fmoc-ODsp）が使用されていますが、ジペプチドの形成は調査されていません（表1、＃11）。

ペプチド構成要素の合成における最大の課題の1つ、すなわちアミノ酸保護中のジペプチドおよびトリペプチドの望ましくない形成を克服するために、多数のFmoc脱離基のアプローチが集中的に研究されてきた。少数の試薬はまともな結果をもたらしましたが、それらのほとんどは工業生産に使用できる可能性を秘めていません。この点で、一般的に使用されているカルボジイミド添加剤オキシムの構造に基づいて、Fmoc脱離基誘導体Fmoc-Amoxが提案されました。Fmoc-Amoxは、副反応が非常に起こりやすいH-Gly-OHを保護するために使用されており、高収率（93％）であり、HPLCおよびNMR分析から確認されるように、Fmoc-ジペプチドの形で副産物はまったくありません。さらに、Amox誘導体は、将来、pNZ、Alloc、Bocなどの他の保護基を導入するために使用される可能性があります。

Ashish グループは、オキシマはカルボジイミドよりも優れた添加剤であると考えています。オキシマは反応性が強く、ペプチドの工業生産でますます広く使用されています。グループはまた、最初のスクリーニング (表 1、#12-16) から、Fmoc 基を導入するための他の反応性の低いオキシム誘導体を調査しました。これには、オキシマ (表 1、#12) から誘導された 2-ヒドロキシピリジン N-オキシド (HOPO) が含まれており、その高い反応性によりジペプチドの含有量が多くなり、HOPO (表 1、#16) がそれに続きました。シアノピリジニウム オキシムも優れた添加剤ですが (表 1、#15)、高価であり、反応から除去するのが困難です。2 番目のスクリーニングでのジペプチドの形成は一般に少なかったため (表 1、#17-20)、Fmoc を導入するために HOSu の代替としてシアノアミド誘導体 (Amox) (表 1、#20) が選択されました。 Fmoc-Amox は手頃な価格で、反応後に簡単に除去できます。MBT の場合とは異なり、Amox は水中で 0.9 M の溶解度を持ち、最終的な Fmoc-アミノ酸を汚染しないことが保証されます (表 1、#4)。

Fmoc-ジペプチドの形成に関しては、立体障害が低くオリゴマー化率が高いため、H-Gly-OH が Fmoc-Amox の性能を評価するための最良の試薬であることが証明されました。1 グラムと 40 グラムを使用して 2 つの並行実験で Fmoc-Gly-OH を調製した結果は近く、反応プロセスは次のように説明されます。Fmoc-Amox のアセトン溶液を、撹拌している H-Gly-OH と炭酸ナトリウム水溶液にゆっくりと加え、連続分離により炭酸ナトリウムをバッチ式に加え、反応混合物の pH を 9～10 に維持します。反応は TLC と pH 安定性 (反応の兆候としての pH の低下) によって監視されました。反応が完了した後（4時間）、溶媒を除去し、残った水層をDCMで洗浄し、続いて1N HCl（pH<2まで）を添加して、オフホワイトの沈殿物を得た。これを濾過し、酢酸エチルおよびn-ヘキサン（93％）で処理した。再結晶後、HPLCで検出されたFmoc-Gly-OHの純度は非常に良好であった。固相技術で調製されたFmoc-Gly-Gly-OHはFmoc-Gly-OHと一緒に溶出されるため、形成されたジペプチド不純物は除去が困難であることを示しています。図3に示すように、クロマトグラムにはジペプチドの痕跡は観察されません（図3）。さらに、1H NMRではAmoxの汚染は見られませんでした（図4）。これは、AmoxがFmocアミノ酸の合成に大きな利点があることを明確に示しています。

図3 (A) Fmoc-Gly-OHとFmoc-Gly-Gly-OHが一緒に溶出するHPLCクロマトグラム
(B) Fmoc-Gly-OHのHPLCクロマトグラム

図4 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Amox、Amoxの1Hおよび13C NMRの比較

これらの結果を参考に、Fmoc-Phe-OH および Fmoc-Val-OH (各 10 g のミニトライアル) を上記の方法を使用して調製しました (図 5 および 6)。最終生成物の純度は HPLC および NMR によって確認され、ジペプチドの痕跡は見られませんでした。また、ワークアップ中の溶媒の重要性も調査しました。得られた生成物を DCM に溶解し、蒸留水を使用して抽出しました。DCM ワークアップにより痕跡量の Amox が除去され、NMR で確認されたように純粋な生成物が得られました (図 7)。

図5 (I) A. Fmoc-Phe-OHとFmoc-Phe-Phe-OHが一緒に溶出するHPLCクロマトグラム
B. Fmoc-Phe-OHのHPLCクロマトグラム
(II) Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Amox、Amoxの1Hおよび13C NMR比較

図6 (I) A. Fmoc-Val-OHとFmoc-Val-Val-OHが一緒に溶出するHPLCクロマトグラム
B. Fmoc-Val-OHのHPLCクロマトグラム
(II) Fmoc-Val-OH、Fmoc-Amox、Amoxの1Hおよび13C NMR比較

図7 酢酸エチルとDCMで抽出したFmoc-Phe-OHの後処理の比較

これらの結果は、Fmoc-Amox が副反応が最も起こりやすい Fmoc アミノ酸の合成において大きな利点があることを明確に示しています。

Fmocアミノ酸の合成例:

1. グリシン（131.34mmol）と炭酸ナトリウム（106mmol）を精製水に加え、Fmoc-Amox（119.4mmol）アセトン溶液を滴下して、反応溶液のpHが常に9〜10に保たれるようにします。TLCでFmoc-Amox反応が完了したことを検出した後、反応溶液を濃縮してアセトンを除去し、次にジクロロメタンで抽出して不純物を取り除きました。水相を1N HClで酸性化し、大量の白色固体が沈殿しました。濾過後、濾過ケーキを精製水で3回洗浄しました。集めた固体を酢酸エチル/n-ヘキサンで再結晶して、高純度のFmoc-グリシンを得ました。

2. 精製水にフェニルアラニンまたはバリン（33mmol）と炭酸ナトリウム（75mmol）を加え、Fmoc-Amox（30mmol）アセトン溶液を滴下して、反応溶液のpHが常に9〜10に保たれるようにします。TLCでFmoc-Amox反応が完了したことを検出した後、反応溶液を濃縮してアセトンを除去し、次にジクロロメタンで抽出して不純物を取り除きました。水相を1N HClで酸性化し、大量の白色固体が沈殿しました。濾過後、濾過ケーキを精製水で3回洗浄しました。集めた固体を酢酸エチル/n-ヘキサンで再結晶して、高純度のFmoc-フェニルアラニンまたはFmoc-バリンを得ました。

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