新しい血管内薬物送達法におけるビオチン化試薬NHS-LCビオチンおよびスルホNHS-LCビオチンの応用

1. 化合物の基本情報

2. 新たな血管内薬物送達法の応用に関する研究

NHS-LC ビオチンは、一級アミン (タンパク質リジンなど) を標識するための長鎖の NHS エステル活性化ビオチン化試薬であり、その膜透過性により一般的な細胞内標識に役立ちます。 Sulfo NHS-LC ビオチンは水溶性で非開裂性であり、溶液中の抗体、タンパク質、およびその他の第一級アミン含有高分子に対する簡単で効果的なビオチン化試薬として使用できます。細胞表面タンパク質の特異的標識は、これらのユニークな水溶性かつ膜不透過性試薬のもう 1 つの一般的な用途です。

勝見のチームは、「内皮ビオチン化とアビジン-ビオチンシステムを利用した新しい血管内薬物送達法」を発表しました。この研究では、カテーテルから注入される新しい血管内薬物送達システムが開発されました。標的組織の血管系に薬物を固定化するために、生きた内皮細胞の細胞タンパク質が最初にビオチン化試薬によって直接ビオチン化されます。 、アフィニティー薬物またはアビジンをリンカーとして使用するビオチン化薬物によって結合されます。

初期実験では、培養ウシ大動脈内皮細胞 (BAEC) のビオチン化を、洗浄した無傷の BAEC 単層にビオチン化試薬 (NHS-LC ビオチンまたはスルホ-NHS-LC ビオチン) を適用することで in vitro で研究し、結合したビオチンの量が細胞は適用されるビオチン試薬の濃度によって異なります。細胞ライセート中のビオチン濃度をライセート中のタンパク質濃度（ngビオチン/μgタンパク質）で割って、実験中に起こり得る細胞損失を考慮して値を正規化します。図 1 は、ビオチン化試薬の用量と細胞溶解物中の補正ビオチン濃度の関係を示しています。細胞溶解物中のビオチン濃度は、ビオチン化試薬の用量が増加するにつれて増加しました。同じ濃度のNHS-LC-ビオチンとスルホ-NHS-LC-ビオチンを比較すると、わずかに多くの細胞タンパク質がNHS-LC-ビオチンによってビオチン化されました。例えば、1.8 mM NHS-LC ビオチンおよび硫黄-NHS-LC ビオチンから調製した細胞溶解物は、タンパク質 1 g あたりそれぞれ 0.390 ng および 0.304 ng のビオチン濃度を持っていました。

細胞結合ビオチンはビオチン化後時間の経過とともに減少し、ビオチン化 BAEC 単層に適用すると FITC アビジンが容易に利用可能になります。セルと組み合わせます。 LDH 放出アッセイでは、スルホ-NHS-LC ビオチンが BAEC に対してわずかに細胞毒性があるだけであることが示され、コロニー形成アッセイでは試薬の軽度の副作用のみが示されました。カテーテルを介して一方の腎臓にNHS-LCビオチン溶液を注入して血管構造をビオチン化し、対照としてもう一方の腎臓にビヒクルを注入し、続いて生理食塩水で灌流することにより、正常ウサギの腎動脈でインビボ研究を実施した。最後に、FITC-アビジン溶液を両方の腎臓に注射しましたが、カテーテルを抜いた後、腎臓は血液とともに拒否されました。組織切片では、ビオチン化腎臓の糸球体の 85% 以上がフルオレセインで染色されましたが、対照の糸球体はいずれも染色されませんでした。同じ手術から 2 日後に採取された腎臓では、ほとんどの糸球体がまだ明るく染色されていました。図 2 は、ビオチン化後、EC 内のビオチン濃度が時間の経過とともに減少することを示しています。硫黄-NHS-LC ビオチンを使用した場合、ビオチン化タンパク質の濃度は時間の経過とともに急速に減少し、24 時間後には少量しか残らなかった。一方、NHS-LC-Biotin を使用した場合、24 時間以内に多数のビオチン分子 (60%) が検出され、48 時間でも約 40% がまだ検出されました。データから計算されたビオチン半減期は、それぞれ 38.0 時間 (NHS-LC ビオチン) および 10.8 時間 (スルホ-NHS LC-ビオチン) でした。

すべての BAEC を、対照として 0.18 ～ 18 mM スルホ-NHS-LC ビオチンによるビオチン化および溶媒曝露の 24 時間後に位相差顕微鏡で調べたところ、すべてのグループの細胞は陰性であり、形態学的異常は示されませんでした。一方、図 3 に示すように、18 mM ビオチン化試薬に曝露したグループは、低用量 (0、0.18、および 1.8 mM) のビオチン化と比較して、LDH レベルのわずかな増加を示しました (Kruskal-Wo Liss 検定、p<%)。 0.02）。

ビオチン化阻害剤が細胞生存率を変えるかどうかを調べるために、コロニー形成アッセイを使用して細胞増殖に対するそれらの影響を調べました。図 4 に示すように、BAEC コロニーの数は試薬濃度の増加とともに減少しました。コロニー形成の阻害は、１．８〜５．４ｍＭで明らかであった（クラスカル・ワリス検定、ｐ＜０．０１）。

この実験では、抗ビオチン化薬物を生存可能なビオチン化 EC に固定化できるかどうかも調査されました。結果を図５に示す。細胞溶解物中のＦＩＴＣ抗ウイルス薬の濃度は、ＦＩＴＣ抗ウイルス薬の初期用量の増加とともに増加した。 FITC-アビジンの初期用量と細胞溶解物中のその濃度の間の相関係数は、NHS-LC-ビオチンを使用した場合は0.987 (p=0.012)、スルホ-NHS-LC-ビオチンを使用した場合は0.977 (p=0.026)でした。

最後の実験では、ビオチン化腎臓に抗ビオチン溶液を注入し、続いてフルオレセインビオチン溶液を注入しました。対照腎臓は事前にビオチン化されていなかったが、上記と同じ抗ビオチンおよびフルオレセインビオチン注射を受け、ビオチン化腎臓では糸球体の80％以上が染色されたが、対照では染色されなかった。これは、ビオチン化薬物が血液によって洗い流されることなく、抗ビオチンを介してビオチン化血管構造に固定できることを示唆しています。ビオチン化腎臓の機能には明らかな副作用は見られず、この薬物送達システムは、悪性腫瘍における微小血管増殖や特定の標的臓器における継続的な薬物送達など、特定の血管病理学的状態の治療に適しています。

この研究では、治療薬を標的領域に送達し、その領域の血管内皮細胞に薬剤を固定する方法を開発するために、生きた内皮細胞のビオチン化が研究されました。この研究の 2 つの重要な要素は、薬物送達のためのカテーテル法の使用と、ビオチン化のための NHS エステルのビオチン誘導体の使用でした。近年の放射線治療の進歩により、血管カテーテルを用いて体内のさまざまな場所に薬物を到達させることが可能となり、モデル臓器であるウサギの腎臓の血管内皮細胞にカテーテルを用いて薬物を送達することに成功しました。これまでに何人かの研究者が、さまざまな目的でビオチンNHSエステル誘導体を使用した、赤血球、リンパ球、内皮細胞などの動物組織細胞のビオチン化を報告しています。 NHS エステルはタンパク質との反応性が高く、NHS エステルを含む化合物は細胞タンパク質によって生細胞に固定化できます。フエンテら。らは、肺内皮をビオチン化するための摘出肺の使用と、その後の血管内注射によるビオチン化試薬の投与を報告した。勝見氏のグループによる研究は、治療目的で血管内皮細胞のビオチン化を初めて利用したものである。