新しい血管内薬物送達法におけるビオチン化試薬NHS-LCビオチンおよびスルホNHS-LCビオチンの応用

1. 化合物の基本情報

2. 新たな血管内薬物送達法の応用に関する研究

NHS-LC ビオチンは、膜透過性により一般的な細胞内標識に有用な第一級アミン (タンパク質リジンなど) を標識するための長鎖 NHS エステル活性化ビオチン化試薬です。スルホ NHS-LC ビオチンは水溶性で非切断性であり、溶液中の抗体、タンパク質、およびその他の第一級アミン含有高分子のシンプルで効果的なビオチン化試薬として使用できます。細胞表面タンパク質の特定の標識化は、これらのユニークな水溶性で膜不透過性の試薬のもう 1 つの一般的な用途です。

勝見教授らの研究チームは、2001年に「血管内皮細胞のビオチン化とアビジン-ビオチン系を利用した新しい血管内薬物送達法」を発表しました。この研究では、カテーテルから注入される新しい血管内薬物送達システムが開発されました。薬物を標的組織の血管系に固定化するために、まず生きた血管内皮細胞の細胞タンパク質をビオチン化試薬で直接ビオチン化し、次にアビジンをリンカーとしてアフィニティー薬物またはビオチン化薬物と結合させます。

初期実験では、培養されたウシ大動脈内皮細胞（BAEC）のビオチン化を、洗浄された完全なBAEC単層にビオチン化試薬（NHS-LCビオチンまたはスルホ-NHS-LCビオチン）を適用することによってin vitroで研究し、細胞に結合するビオチンの量は適用したビオチン試薬の濃度に依存することを示しました。実験中に起こり得る細胞損失を考慮に入れるために値を正規化するには、細胞溶解物中のビオチン濃度を溶解物中のタンパク質濃度（ngビオチン/μgタンパク質）で割ります。図1は、ビオチン化試薬の投与量と細胞溶解物中の補正ビオチン濃度の関係を示しています。細胞溶解物中のビオチン濃度は、ビオチン化試薬の投与量が増加するにつれて増加しました。同じ濃度のNHS-LCビオチンとスルホ-NHS-LCビオチンを比較すると、NHS-LCビオチンによってわずかに多くの細胞タンパク質がビオチン化されました。例えば、1.8 mM NHS-LC ビオチンとスルホ-NHS-LC ビオチンから調製した細胞溶解物では、ビオチン濃度はそれぞれタンパク質 1 g あたり 0.390 ng と 0.304 ng でした。

細胞に結合したビオチンはビオチン化後、時間の経過とともに減少し、FITC-アビジンはビオチン化されたBAEC単層に適用すると容易に利用可能になります。細胞と結合します。LDH放出アッセイでは、スルホ-NHS-LCビオチンはBAECに対してわずかな細胞毒性しか示さず、コロニー形成アッセイでは試薬の軽度の副作用しか示されませんでした。正常なウサギの腎動脈に対するin vivo研究では、NHS-LCビオチン溶液をカテーテルを通して一方の腎臓に注入して血管系をビオチン化し、対照としてもう一方の腎臓に媒体を注入し、続いて生理食塩水で灌流しました。最後に、FITC-アビジン溶液を両方の腎臓に注入し、カテーテルを引き抜いた後、血液を拒絶しました。組織切片では、ビオチン化された腎臓の糸球体の85%以上がフルオレセインで染色されましたが、対照の糸球体は染色されませんでした。同じ手術の2日後に採取した腎臓では、ほとんどの糸球体がまだ明るく染色されていました。図2は、ビオチン化後、EC中のビオチン濃度が時間の経過とともに減少することを示しています。スルホ-NHS-LCビオチンを使用した場合、ビオチン化タンパク質の濃度は時間の経過とともに急速に減少し、24時間後にはわずかな量しか残っていませんでした。一方、NHS-LC-ビオチンを使用した場合、24時間以内に多数のビオチン分子（60％）が検出され、48時間後も約40％がまだ検出されていました。データから計算されたビオチン半減期は、それぞれ38.0時間（NHS-LCビオチン）と10.8時間（スルホ-NHS LC-ビオチン）でした。

すべてのBAECは、対照として0.18-18 mMのスルホ-NHS-LCビオチンと溶媒曝露によるビオチン化の24時間後に位相差顕微鏡で検査され、すべてのグループの細胞は陰性であり、形態学的異常は見られませんでした。一方、図3に示すように、18 mMビオチン化試薬に曝露されたグループは、低用量（0、0.18、1.8 mM）のビオチン化と比較して、LDHレベルのわずかな上昇を示しました（Kruskal-Wo Liss検定、p<0.02）。

ビオチン化阻害剤が細胞生存率を変化させるかどうかを調べるために、コロニー形成アッセイを使用して細胞増殖に対する効果を調べました。図 4 に示すように、試薬濃度が増加すると BAEC コロニーの数は減少しました。コロニー形成の阻害は 1.8～5.4 mM で明らかでした (Kruskal-Wallis 検定、p<0.01)。

この実験では、抗ビオチン化薬剤を生きたビオチン化ECに固定化できるかどうかも調査しました。結果は図5に示されており、FITC抗ウイルス剤の初期投与量の増加とともに、細胞溶解物中のFITC抗ウイルス剤の濃度も増加しました。FITCアビジンの初期投与量と細胞溶解物中の濃度の相関係数は、NHS-LC-ビオチンを使用した場合は0.987（p=0.012）、スルホ-NHS-LC-ビオチンを使用した場合は0.977（p=0.026）でした。

最終実験では、ビオチン化腎臓に抗ビオチン溶液を注入し、続いてフルオレセイン-ビオチン溶液を注入しました。対照腎臓は事前にビオチン化されていませんでしたが、上記と同じ抗ビオチンとフルオレセインビオチンを注入したところ、ビオチン化腎臓では80%以上の糸球体が染色されましたが、対照腎臓では染色されませんでした。これは、ビオチン化薬物が抗ビオチンを介してビオチン化血管系に固定され、血液によって洗い流されることがないことを示唆しています。ビオチン化腎臓の機能に明らかな副作用は見られず、この薬物送達システムは、悪性腫瘍の微小血管増殖などの特定の血管病理学的状態の治療や、特定の標的臓器への持続的な薬物送達に適しています。

本研究では、治療薬を標的部位に送達し、その部位の血管内皮細胞に薬物を固定する方法を開発するために、生きた内皮細胞のビオチン化を調査した。本研究の2つの重要な要素は、薬物送達のためのカテーテル法の使用と、ビオチン化のためのNHSエステルのビオチン誘導体の使用であった。最近の介入放射線学の進歩により、血管カテーテル法を使用して体内の多くの場所に到達できるようになり、カテーテル法を使用して、モデル臓器としてのウサギの腎臓の血管内皮細胞に薬物を送達した。これまでに数人の研究者が、さまざまな目的でビオチンNHSエステル誘導体を使用して、赤血球、リンパ球、内皮細胞などの動物組織細胞をビオチン化したことを報告している。NHSエステルはタンパク質との反応性が高く、NHSエステルを含む化合物は細胞タンパク質によって生きた細胞上に固定化できる。Fuente et al.分離した肺を使用して肺内皮をビオチン化し、続いてビオチン化試薬を血管内注射で投与することを報告した。勝見氏のグループによる研究は、血管内皮細胞のビオチン化を治療目的に使用した初めての研究である。