1. クロロホルム試薬のグレードの違い
文献によると、この化合物の比旋光度測定のためのサンプル調製にはクロロホルム溶媒を使用しました。当然のことながら、分析グレード（AR）の試薬を使用しました。しかし、お客様のデータと当社のデータに大きな差があったため、よりグレードの高いクロマトグラフィー（HPLC）グレードの試薬を使用してサンプルを再調製したところ、化合物の比旋光度が元のデータよりもはるかに大きいことがわかりました。クロロホルムは光酸化されて塩化水素（HCl）を生成し、これが化合物に影響を与える可能性があることを考慮し、クロロホルム試薬のpH値を測定したところ、問題はありませんでした。最後に、クロロホルムのCOAを調べたところ、ARグレードのクロロホルム試薬にはクロロホルムの安定性を確保するために一定量のエタノール（国内標準0.3%～1%）が含まれていることがわかりました。一方、国内のHPLCグレードのクロロホルム試薬にはエタノール含有量が記載されていないため、0%であると考えられます。一般的に、このような微量のエタノール含有量は比旋光度の測定に大きな影響を与えないと考えられます。しかし、私たちの実験結果によると、同じ化合物のAR溶媒とHPLC溶媒での比旋光度には6％以上の誤差があります。このため、ARグレードのクロロホルム試薬に異なる量のエタノールを加え、化合物に対して一連の比旋光度テストを実施しました。図1に示すように、クロロホルム中のエタノール含有量は化合物の比旋光度に大きな影響を与えることがわかりました。
同じ化合物は、AR溶媒とHPLC溶媒でそれぞれ116.64と124.36の比旋光度を得ました。これは、HPLCグレードのクロロホルム試薬では、エタノール含有量は基本的に0％または0％に近いと決定されており、私たちが使用するARグレードの試薬には約0.75％のエタノールが含まれていることを示しています。異なる企業が独自の標準操作手順に従ってテストサンプルを構成するために、特定のレベルの試薬を使用することがあります。これは、企業間で通信する際に明確にして検証する必要があります。
表1 比旋光度と溶媒中のエタノールの割合の関係
（ARグレード試薬クロロホルム中のエタノール含有量は含みません）
図1 比旋光度と溶媒中のエタノールの割合の関係
（ARグレード試薬クロロホルム中のエタノール含有量は含みません）
2. フィルタリングとフィルタリングしないことの違い
この調査では、溶液中に浮遊する肉眼では見えない微粒子が旋光度試験の安定性に大きな影響を与えていることも判明しました。試料溶液を0.22μmの有機フィルター膜でろ過した後、機器の試験データ（小数点以下3桁）の有効数字内で完全に一貫性のある試験結果が得られ、非常に高い再現性を示しました。
表2 HPLCグレードとARグレードのクロロホルム溶媒の比旋光度結果の差
表3 サンプル溶液をろ過した場合とろ過しなかった場合の比旋光度測定結果の違い（同じ溶媒）
図3 試料溶液をろ過した場合とろ過しない場合の比旋光度の違い（同じ溶媒）
結論
この問題の発生と調査を通して、試験条件を策定する際には、高水準の試薬や化学薬品を使用するだけでなく、試薬を含む使用する材料や物品について詳細かつ十分に理解し、それらを操作手順に明記することで、合理的な試験条件下で高い再現性と精度を備えた最良の試験結果が得られるようにする必要があることを改めて認識しました。
注：本稿で使用した旋光計は、米国ルドルフ・リサーチ・アナリティカル社製の自動旋光計「AUTOPOL I」（温度制御は20℃）です。
